研究簡介：選擇性和滲透率通過界面聚合，制備了頂層薄而致密的復(fù)合膜。雖然優(yōu)化這種膜是很先進(jìn)的，但在這種密集的選擇層上傳輸需要高跨膜壓力和高能量消耗。在細(xì)胞尺度上，生物膜滿足上述許多標(biāo)準(zhǔn)。生物膜將細(xì)胞或細(xì)胞組分分開，并且主要由厚度小于10nm的致密磷脂雙層組成。磷脂雙層包含膜蛋白，其使得信號傳遞和分子選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)穿過膜。連接膜兩側(cè)的膜蛋白被稱為跨膜蛋白，并且一些跨膜蛋白（TP）形成納米孔。研究人員將鐵蛋白聚合物偶聯(lián)到超薄膜上，并通過蛋白質(zhì)變性形成納米孔。使用天然成孔跨膜蛋白代替鐵蛋白，合成了跨膜蛋白（TP）聚合物綴合物，其通過在Pickering乳液界面處的組裝和隨后的聚合物鏈的UV交聯(lián)轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的膜。提出了一個(gè)簡單的方法集成到平面超薄膜的功能性跨膜蛋白（TP），這種策略是基于Langmuir技術(shù)和同雙官能團(tuán)交聯(lián)劑戊二醛，是一種有效的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑和已知的不影響蛋白質(zhì)構(gòu)象在許多情況下。在研究中，F(xiàn)huA分子在朗繆爾槽的空氣-水界面處鋪展。在用Langmuir槽的兩個(gè)可移動屏障壓縮時(shí)，形成致密的2D膜并通過戊二醛交聯(lián)穩(wěn)定。使用Langmuir-Schaefer方法將單層或多層交聯(lián)的FhuA膜轉(zhuǎn)移到各種基底材料上。

Kibron LB 膜分析儀的的應(yīng)用

用乙醇徹底清潔Langmuir槽，用Millipore純水沖洗，并填充磷酸鹽緩沖液。隨后，將Langmuir槽的屏障完全封閉，吸附的顆粒從空氣-水界面吸走，磷酸鹽緩沖液從屏障后面重新填充。重復(fù)該過程，直到在完全屏障壓縮時(shí)測量的清潔空氣-水界面的表面壓力的上升小于或等于0.05mN/m-1在典型的膜制造實(shí)驗(yàn)中，將50μL FhuA溶液（FhuA濃度為6.3×10-6 M的MPD緩沖液中）加入到反應(yīng)器中。平衡2小時(shí)后，將朗繆爾槽的屏障設(shè)置為以1 mm/min的速度運(yùn)動將吸附的FhuA單層壓縮至25 mN/m的表面壓力，在保持表面壓力恒定的同時(shí)，將1.76mL戊二醛溶液（50wt%的H2O溶液）加入到反應(yīng)器中。在空氣中干燥之前，將轉(zhuǎn)移的FhuA膜在MPD溶液（5%體積MPD的Millipore純水溶液）中通過浸漬三次來洗滌。平衡2小時(shí)后，Langmuir槽的屏障以1 mm min-1的速度運(yùn)動，將吸附的FhuA單層壓縮到25 mN m-1的表面壓力。在保持表面壓力不變的情況下，將1.76 mL戊二醛溶液(50 wt%in H2O,Sigma-Aldrich,USA)從Langmuir槽屏障后注入磷酸鹽緩沖亞相。交聯(lián)至少進(jìn)行2小時(shí)，直到FhuA膜按照Langmuir-Schaefer方法轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的底物上。在空氣中干燥之前，將轉(zhuǎn)移的FhuA膜在MPD溶液(5 vol%MPD在Millipore純凈水中)中浸洗三次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

介紹了一種制造超薄但機(jī)械穩(wěn)定的膜的新方法，該膜包含TP FhuA，其天然形成限定的納米孔。由于其厚度低和本研究中推斷的極高密度的集體對齊蛋白質(zhì)，與常規(guī)納濾膜相比，這種膜具有非常高的水滲透性。由兩種不同的FhuA變體制成的膜反映了每種變體的分子性質(zhì)，在此關(guān)于離子滲透性進(jìn)行了證明。我們的膜有潛力作為一個(gè)平臺技術(shù)，允許定制膜根據(jù)個(gè)人的過程要求。膜制造使用了研究良好的Langmuir技術(shù)和一個(gè)共同的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，這確保了良好的可擴(kuò)展性，著眼于未來的應(yīng)用。

圖1、跨膜蛋白FhuA的交聯(lián)2D膜片。a）使用β-桶蛋白FhuA（跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A）的兩種變體。在FhuA WT中，軟木結(jié)構(gòu)域阻塞大部分孔內(nèi)部，而該軟木結(jié)構(gòu)域被生物技術(shù)去除以形成開孔變體FhuA?CVF電子伏特兩種FhuA變體具有相同的尺寸，并且其特征在于蛋白質(zhì)上部的親水性環(huán)區(qū)和蛋白質(zhì)下部的疏水性跨膜區(qū)。b）應(yīng)用Langmuir技術(shù)形成超大2D FhuA膜片。（i）由于它們的兩親性，當(dāng)擴(kuò)散到空氣-水界面時(shí)，F(xiàn)huA分子占據(jù)很大程度上直立的取向。（ii）當(dāng)在朗繆爾槽的屏障之間緊密壓縮并與戊二醛交聯(lián)時(shí)，F(xiàn)huA膜片可以通過重復(fù)的水平浸漬層疊在基底的頂部。c）由FhuA WT（左）或FhuA?CVF制成的膜的示意性俯視圖電子伏特d）FhuA膜在水和離子滲透方面進(jìn)行表征。

圖2、a）在空氣-水界面處的FhuA膜并轉(zhuǎn)移到基底上。（i）吸附，（ii）壓縮，和（iii）在膜制造期間從0.32nmol FhuA WT涂布在磷酸鹽緩沖液頂部測量的谷面積-時(shí)間曲線在（ii）和（iii）中，戊二醛的注射用箭頭標(biāo)記。B）相應(yīng)的BAM成像顯示（i）在高達(dá)30 mN/m的表面壓力下均質(zhì)的FhuA膜-1.（ii）表面壓力超逾30mN/m）（i）一個(gè)或（ii）兩個(gè)FhuA膜片的AFM圖像，所述膜片層疊在硅基底的頂部上（左半部分用注射器尖端刮去）。高度分布屬于圖像中的虛線，并且指示（i）5和（ii）9 nm的膜厚度。d）單個(gè)FhuAΔCVF的共聚焦熒光顯微鏡圖像，用熒光標(biāo)記物標(biāo)記的硅襯底上的薄膜片e）獨(dú)立地覆蓋TEM網(wǎng)格（淺灰色）的結(jié)構(gòu)化碳膜中的孔（深灰色）的FhuA WT膜的HIM圖像。黑色區(qū)域顯示膜中的缺陷。

圖3、空氣-水界面處的FhuA膜BAM（布呂斯特角顯微鏡）圖。(a)在MPD緩沖液中擴(kuò)散FhuA WT之前和(b)之后的Langmuir槽氣-水界面BAM圖像;和(c-f)在不同表面壓力下的屏障壓縮。涂敷后立即在空氣-水界面上吸附一層致密均勻的FhuA WT膜。FhuA WT膜可以被壓縮到高達(dá)25 mN/m的表面壓力，而不會表現(xiàn)出不均勻性。在表面壓力為30 mN/m時(shí)，在FhuA WT薄膜中可以看到垂直于壓縮方向的細(xì)長裂紋。

圖4、在FhuA單層膜上的AFM測量.a）當(dāng)（i）未覆蓋和（ii）覆蓋有FhuA膜時(shí)在其中心具有單個(gè)孔的氮化硅膜窗口的示意圖.（iii）在PeakForce QNM模式下AFM成像期間FhuA膜涂覆的氮化硅膜窗口的橫截面（b-d）當(dāng)（b）孔未被FhuA膜覆蓋，（c）孔被破裂的FhuAΔCVF膜覆蓋時(shí)，氮化硅膜窗口中的孔的AFM高度圖像膜，和（d）孔被一個(gè)完整的FhuAΔCVFtev膜層覆蓋（d）和（e）中的高度和變形圖像是同時(shí)獲得的，并且所有圖像都是在水中測量的。（d）和（e）中的高度和變形曲線分別屬于圖像中的虛線。

圖5、通過FhuA膜的水和離子滲透。a）覆蓋有氮化硅膜窗口的充水容器的示意圖，其用于測量FhuA WT膜的水滲透。由從杯內(nèi)到杯外的水蒸氣壓差驅(qū)動（pi-p0）（a）中所示的杯子的照片。c）FhuA WT膜的水滲透性為3.87×104 mol Pa-1 m?2 s-1（空參考25.13×104 mol Pa-1 m?2 s-1誤差條表示至少三個(gè)樣品的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。d）用于測量FhuA膜的離子滲透性的實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖。離子在電極之間擴(kuò)散的唯一方式是滲透氮化硅膜窗口中的孔頂部的FhuA膜。e）在磷酸鹽緩沖液（10×10?3 m NaCl，10×10?3 m恒定斜率對應(yīng)于4.0mS（空參比）、3.4mS（FhuA?CVF）、3.4mS（FhuA?CVF）和3.4mS（FhuA?CVF）的電極之間的恒定電導(dǎo).

總結(jié)

通過具有納米孔的膜的過濾通常與高跨膜壓力和高能量消耗有關(guān)。這個(gè)問題可以通過減少各自的膜厚度來解決。本研究描述了一種簡單的方法來制備基于蛋白質(zhì)納米孔的超薄膜，該膜具有優(yōu)異的透水性，比同類工業(yè)應(yīng)用膜高出兩個(gè)數(shù)量級。此外，結(jié)合封閉或開放的蛋白質(zhì)納米孔可以調(diào)整膜的離子滲透性。為了形成這樣的膜，跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A(FhuA)或其開孔變體在Langmuir槽的空氣-水界面組裝，壓縮成致密膜，通過戊二醛交聯(lián)，并轉(zhuǎn)移到各種支撐材料上。這種方法可以制備具有高密度蛋白質(zhì)納米孔的單層或多層膜。通過原子力顯微鏡(AFM)、氦離子顯微鏡和透射電子顯微鏡可以看到覆蓋直徑達(dá)5μm孔的獨(dú)立膜。AFM最大推力定量納米力學(xué)性能映射(PeakForce QNM)表明，厚度僅為5 nm的獨(dú)立單層膜具有顯著的力學(xué)穩(wěn)定性和彈性性能。這種新型蛋白質(zhì)膜可以為節(jié)能納濾鋪平道路。