摘要

研究了兩種抗菌肽magainin 2和indolicidin與三種不同模型生物膜的相互作用，即單層膜、大單層囊泡（luv）和巨大脂質(zhì)體。當(dāng)1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（SOPC）膜中的酸性磷脂1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油（POPG）的含量增加時，兩種肽插入脂質(zhì)單層的能力逐漸增強(qiáng)。吲哚青霉素和馬蓋寧2也滲透到含有膽固醇的脂質(zhì)單層中（摩爾分?jǐn)?shù)，X=0.1）。通過含芘脂肪酸的磷脂衍生物1-棕櫚酰-2-[10-（芘-1-基）癸?；鵠-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油（PPDPG）的準(zhǔn)分子/單體熒光比Ie/Im的降低，揭示了magainin 2的膜結(jié)合減弱了含POPG的LUV中的脂質(zhì)側(cè)向擴(kuò)散。同樣，觀察到含有二苯基己三烯（DPH）的膜的穩(wěn)態(tài)熒光各向異性增加，揭示了magainin 2增加?；滍樞虿⒄T導(dǎo)酸性磷脂分離。吲哚西丁也有類似的作用。用光學(xué)顯微鏡觀察了magainin2和吲哚青霉素對磷脂膜的拓?fù)湫?yīng)。Magainin 2對SOPC或SOPC:膽固醇（X=0.1）巨型脂質(zhì)體基本沒有影響。然而，當(dāng)酸性磷脂（XPG=0.1）包含在巨大囊泡中時，觀察到有效的囊泡形成。吲哚西丁只引起巨大SOPC囊泡的輕微收縮，而當(dāng)巨大脂質(zhì)體含有POPG（XPG=0.1）時，觀察到內(nèi)吞囊泡的形成。有趣的是，對于吲哚肽，由SOPC/膽固醇（Xchol=0.1）組成的巨大囊泡也可觀察到囊泡形成。討論了這兩種多肽誘導(dǎo)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制。

介紹

在過去十年中，在動植物和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了越來越多的抗菌肽，如天蠶素、防御素、馬蓋寧、蜂毒素、吲哚青霉素和阿拉米霉素。這些肽在脊椎動物和無脊椎動物中用于進(jìn)攻和防御目的（Sansom，1991；Saberwal和Nagaraj，1994；Matsuzaki，1998），通過與脂質(zhì)相互作用，以某種方式干擾靶細(xì)胞膜的屏障特性（Bechinger，1997；Matsuzaki，1998，1999；Oren和Shai，1998；Shai，1999；Sitaram和Nagaraj，1999）。作為陽離子，抗菌肽優(yōu)先與細(xì)菌中特別豐富的酸性脂質(zhì)相互作用（Op den Kamp，1979），從而為細(xì)胞特異性的差異提供了基礎(chǔ)（Matsuzaki等人，1995a）。上述特性使這些肽成為研究脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一個有趣領(lǐng)域，并可能進(jìn)一步開發(fā)新的抗菌、抗癌和抗病毒化合物。

我們在這里報告了兩種抗菌肽，馬蓋寧2和吲哚青霉素與脂膜相互作用的比較。Magainin和indolicidin根據(jù)其氨基酸組成和二級結(jié)構(gòu)屬于不同的抗菌肽家族（Falla等人，1996年）。因此，magainin是類脂膜中呈現(xiàn)兩親性=-螺旋結(jié)構(gòu)的一個范例（Matsuzaki，1999），而吲哚肽屬于另一個類脂雙層中具有獨(dú)特氨基酸組成和非α-螺旋構(gòu)象的類脂（Ladokhin et al.，1999；Ha et al.，2000）。在非洲爪蟾爪蟾的皮膚中發(fā)現(xiàn)了Magainins，并在非溶血濃度下顯示出廣譜抗菌（Zasloff，1987；Zasloff等人，1988）和抗癌細(xì)胞活性（Crucani等人，1991；Baker等人，1993）。為此，有興趣的青蛙皮膚提取物已被用于中醫(yī)藥中的皮膚感染的控制（L.Miao，羅斯基勒大學(xué)，個人通信，2000）。Magainin 2由23個氨基酸殘基（GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS）組成，具有4的正凈電荷，并通過滲透細(xì)菌膜發(fā)揮其抗菌活性（Matsuzaki等人，1997年）。已經(jīng)提出形成肽-脂質(zhì)超分子復(fù)合物孔，允許離子、脂質(zhì)和肽的跨雙層運(yùn)輸，同時跨膜電位和脂質(zhì)不對稱性的耗散（Matsuzaki et al.，1995a，b，c，1996，1998；Ludtke et al.，1996）。magainin對亞微觀脂質(zhì)囊泡作用的光譜和動力學(xué)研究（Matsuzaki等人，1995a，b，c，1996，1998；Ludtke等人，1996）揭示了相互作用的協(xié)同性質(zhì)。然而，magainin對膜擾動的確切機(jī)制仍存在爭議。

吲哚青霉素存在于牛中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)顆粒中（Selsted等人，1992年），具有獨(dú)特的氨基酸組成，其13個氨基酸序列中有5個Trp和3個Pro殘基（ILPWR）。它是最短的天然線性抗菌肽之一，與magainin類似，對革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌（Selsted et al.，1992）和真菌（Ahmad et al.，1995）以及原生動物（Aley et al.，1994）具有活性。吲哚西丁對大鼠和人T淋巴細(xì)胞也有細(xì)胞毒性（Schluesener等人，1993年），分解紅細(xì)胞（Ahmad等人，1995年），并具有抗HIV-1的活性（Robinson等人，1998年）。吲哚肽優(yōu)先與酸性磷脂結(jié)合，盡管它也與中性磷脂結(jié)合（Ladokhin等人，1997）。已證明吲哚青霉素可滲透大腸桿菌外膜（Falla等人，1996年；Subbalakshmi等人，1996年），形成通道，如平面雙層電導(dǎo)測量所示（Falla等人，1996年；Wu等人，1999年）。吲哚西丁對細(xì)胞膜的高親和力、不尋常的氨基酸組成和小體積使其成為一種有趣的抗菌劑。其抗菌活性、電荷要求以及Trp和Pro殘基對生物活性的重要性已被廣泛研究（Sitaram和Nagaraj，1999）。然而，肽介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的分子機(jī)制，即肽是否形成孔隙、像洗滌劑一樣溶解膜或誘導(dǎo)膜缺陷，仍然存在爭議（Sitaram和Nagaraj，1999）。

小的和大的單層囊泡（LUV）繼續(xù)被廣泛用作模型膜。然而，這些脂質(zhì)體是亞微觀的，不允許分辨與生物膜更宏觀變化相關(guān)的形態(tài)學(xué)特征。所謂的巨大囊泡（10–500 m）是一種球形、封閉的分子雙層結(jié)構(gòu)，它能包裹一個水室，是研究波動、萌芽、損傷和愈合的良好模型，以及膜作用試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞樣行為的其他表現(xiàn)（Riquelme等人，1990年；Menger，1998年；Menger和Lee，1995年；Menger和Keiper，1998年；Angelova和Tsoneva，1999年；Angelova等人，1999年；Holopainen等人，2000年）。由于巨大的囊泡體積大，可以通過光學(xué)顯微鏡觀察到，從而可以直接可視化涉及超分子化學(xué)和生物物理學(xué)的過程（Luisi和Walde，2000）。在這項研究中，我們分別使用不同的膜模型，即單層膜、大的單層囊泡和巨大的脂質(zhì)體，來研究馬加寧和吲哚西定在膜中的滲透，它們對雙層脂質(zhì)動力學(xué)的影響，以及膜的宏觀形態(tài)變化。

材料和方法

材料

Hepes、EDTA和magainin 2來自西格瑪（密蘇里州圣路易斯），吲哚西丁來自巴切姆（瑞士布本多夫）。經(jīng)各自供應(yīng)商提供的高效液相色譜分析驗證，肽的純度分別>99%和>95%。通過質(zhì)譜證實了馬蓋寧2和吲哚青霉素的正確分子量和純度。1-硬脂酰-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿（SOPC）、1-棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸甘油（POPG）和>-膽固醇來自Avanti極性脂質(zhì)（Alabaster，AL）。對于熒光磷脂類似物，1-棕櫚酰-2-[10-（芘-1-基）癸酰]-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油（PPDPG）和1-棕櫚酰-2-[10-（芘-1-基）癸酰]-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PPDPC）來自K&V Bioware（芬蘭埃斯波）。二苯基己三烯（DPH）來自EGA Chemie（Steinheim，德國）。使用高精度電子天平（Cahn，Cerritos，CA）通過重量法測定未標(biāo)記脂質(zhì)的濃度，并使用摩爾消光系數(shù)分別為38000 cm-1和88000 cm-1，通過341 nm處的吸光度法測定含芘磷脂和DPH的濃度。脂質(zhì)的純度通過薄層色譜法在使用氯仿/甲醇/水（65:25:4，v/v/v）開發(fā)的硅酸涂層板（德國達(dá)姆施塔特默克公司）上進(jìn)行檢查。碘染色后以及適當(dāng)情況下，紫外線照射后對平板進(jìn)行檢查，未發(fā)現(xiàn)任何雜質(zhì)。

肽在脂質(zhì)單層中的滲透

使用磁攪拌環(huán)形聚四氟乙烯孔（多孔板，亞相體積1.2 ml，芬蘭赫爾辛基基布隆）測量肽對單分子脂質(zhì)膜的滲透。表面壓力（π）通過連接到連接到奔騰PC的微量天平（Delta-Pi，Kibron）上的Wilhelmy線進(jìn)行監(jiān)測。將脂質(zhì)在氯仿（~1 mg/ml）中以指定的摩爾比混合，然后在該溶劑中擴(kuò)散到空氣緩沖（5 mM Hepes，0.1 mM EDTA，pH 7.0）界面上。隨后，在向亞相注入馬蓋寧2或吲哚青霉素之前，讓脂質(zhì)單層在不同初始表面壓力（π0）下平衡約15分鐘。肽的最終濃度為1m。注射肽后的增量π在約30min內(nèi)完成，初始表面壓力（π0）與肽滲透到膜中后觀察到的值之間的差值取為?π.所示數(shù)據(jù)表示三次測量的平均值，表示為?π對π0。所有測量均在環(huán)境溫度（~24°C）下進(jìn)行。

LUV的制備

指示的脂質(zhì)在氯仿中混合，然后在氮?dú)饬飨氯コ軇S后在減壓下保持脂質(zhì)殘余至少2小時。然后在50°C下水合干燥脂質(zhì)，以產(chǎn)生1 mM的脂質(zhì)濃度。使用Lipsofast低壓均質(zhì)器（加拿大渥太華Avestin）通過兩個聚碳酸酯過濾器（孔徑100 nm，微孔，貝德福德，馬薩諸塞州）的堆疊擠出所得分散體，以獲得LUV。

Ie/Im的測量

芘是準(zhǔn)分子形成有機(jī)熒光團(tuán)的典范，其衍生物在生物分子研究中得到了廣泛的應(yīng)用。單體芘發(fā)射波長約為398nm的熒光，準(zhǔn)分子（激發(fā)二聚體）通過發(fā)射波長約為480nm的熒光松弛回到兩個基態(tài)芘。穩(wěn)態(tài)Ie/Im值為探針碰撞頻率的質(zhì)量變化提供了一個相當(dāng)好的度量，反映了芘標(biāo)記脂質(zhì)的橫向擴(kuò)散和局部濃度（簡要回顧，見Kinnunen等人，1993年；Duportail和Lianos，1996年）。使用Perkin Elmer LS50B熒光光譜儀和磁攪拌恒溫反應(yīng)杯室，使用344 nm的激發(fā)波長測量用PPDPG或PPDPC（X=0.01）標(biāo)記的LUV的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射均使用5nm的帶寬。使用的脂質(zhì)濃度為25 M，溫度保持在25°C。添加適量肽后，在記錄光譜之前，樣品平衡5分鐘。取三次掃描的平均值，分別在~398和480 nm處測量Im和Ie的發(fā)射強(qiáng)度。所有測量重復(fù)三次。

DPH的熒光各向異性

DPH以X=0.002加入脂質(zhì)體中。使用的脂質(zhì)濃度為25m，溫度保持在25°C。使用帶有Perkin Elmer LS50B的寶麗來型濾光片以L格式測量偏振發(fā)射。使用5αnm帶寬，在360 nm激發(fā)和450 nm發(fā)射下測量DPH的熒光各向異性r，并使用Perkin Elmer提供的軟件程序計算其值。所有測量重復(fù)三次。

巨大脂質(zhì)體的形成

如其他地方所述制備巨型脂質(zhì)體（Angelova和Dimitrov，1986；Holopainen等人，2000）。簡單地說，將約1–3 l溶解在二乙醚：甲醇（9:1，v/v，最終總脂質(zhì)濃度1 mM）中的所需脂質(zhì)攤鋪在兩個鉑電極的表面上，隨后在氮?dú)饬飨赂稍?。在真空中抽?小時，去除可能殘留的有機(jī)溶劑。在蔡司IM-35倒置熒光顯微鏡的工作臺上放置一個帶有附加電極和石英窗口底部的玻璃室。在添加1.3 ml pH值為7.4的0.5 mM Hepes緩沖液之前，施加交流磁場（頻率為4 Hz，振幅為0.2 V的正弦波函數(shù)）。在水合作用的第一分鐘內(nèi)，電壓增加到1.0–1.2 V。2–4小時后關(guān)閉交流電場，并使用Hoffman調(diào)制對比度（HMC）光學(xué)系統(tǒng)和10/0.25物鏡觀察巨大脂質(zhì)體（調(diào)制光學(xué)系統(tǒng)，紐約州紐約）。巨型脂質(zhì)體的大小通過微移液管的運(yùn)動校準(zhǔn)圖像，作為微操作器（MX831，帶MC2000控制器，SD Instruments，Grants Pass，Oregon）步長（50 nm）的適當(dāng)倍數(shù)來測量。使用帕爾貼冷卻12位數(shù)字CCD攝像機(jī)（C4742-95，日本濱松市濱松）記錄圖像，該攝像機(jī)與計算機(jī)連接，并由制造商提供的軟件（HiPic 5.0.1）操作。

微量注射技術(shù)

用微處理器控制的水平拉拔器（P-87，Sutter Instrument Co.，加利福尼亞州諾瓦托）用硼硅酸鹽毛細(xì)管（外徑1.2-mm）制成內(nèi)徑>0.5 m的微量移液管（Schnorf et al.，1994）。指示量的肽溶液（10mmHEPES中的0.5mm，0.1mmEDTA，pH 7.0）以氣動微注射器（PLI-100，醫(yī)療系統(tǒng)公司，紐約州格林維爾）輸送的一系列單次注射~20FL的形式應(yīng)用于單個巨大囊泡的外表面。為便于操作，僅使用附著在電極表面的囊泡。所有實驗均在環(huán)境溫度（~24°C）下進(jìn)行，并重復(fù)至少10次。