摘要：牡蠣低分子肽(low molecular weight oyster peptides，LOPs)具有多種生物活性，但是存在腥味及易于被胃腸消化液降解的缺陷，采用雙重乳液包封LOPs可顯著改善其腥味，然而其消化吸收特性相關(guān)研究較少。以LOPs為研究對象，分析其界面性質(zhì)，采用W1/O/W2型雙重乳液封裝LOPs，利用體外模擬消化及單層Caco-2細(xì)胞模型研究LOPs的消化吸收特性。研究結(jié)果顯示:LOPs具有較好的親水性但不具有降低油水間界面張力的能力。在體外模擬消化過程中，LOPs雙重乳液平均粒徑由最初的(725.5±25.4)nm先增至(944.6±21.8)nm，最后降低為(772.8±21.4)nm;包封率由88.35%逐步降至30.01%;光學(xué)顯微圖像顯示，乳液在胃消化模擬階段出現(xiàn)了不同程度的聚集，并于腸道消化階段出現(xiàn)破裂。單層Caco-2細(xì)胞模型的體外模擬吸收實驗結(jié)果顯示，LOPs的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動擴(kuò)散，而LOPs雙重乳液的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為外流效應(yīng)。LOPs雙重乳液能有效提高LOPs的生物利用率，對LOPs具有良好的保護(hù)與緩釋作用。

牡蠣是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一，富含蛋白質(zhì)、糖原、牛磺酸以及微量元素，為藥食兩用原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價值。牡蠣低分子肽(low molecular weight oyster peptides，LOPs)是以牡蠣為原料，通過生物酶解、微生物發(fā)酵等技術(shù)加工制備而成的生物活性肽。近年來，大量研究證實，牡蠣肽具有抗菌、降血壓、抗凝血、抗炎、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫及改善腸道菌群等多種生物活性。然而，直接食用LOPs，其活性可能由于口腔的咀嚼、胃環(huán)境的胃酸、蛋白酶降解以及膽汁鹽、各種胰酶和小腸黏液的作用而降低。同時，由于牡蠣來源于海洋，經(jīng)酶解干燥后制備的LOPs具有高吸濕性和一定的腥味，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，探索一種有效包封、保護(hù)和緩釋LOPs的技術(shù)，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的實際應(yīng)用價值。

雙重乳液是將乳液作為分散相分散于另一不溶相中，其由內(nèi)相、中間相和外相三相組成。雙重乳液分為水包油包水(W1/O/W2)、油包水包油(O1/W/O2)兩種形式，具有掩蓋化合物的不良感官特性，保護(hù)敏感的封裝化合物免受外界因素的影響，緩慢釋放封裝的化合物等優(yōu)點。W1/O/W2型雙重乳液能夠較好地封裝水溶性生物活性物質(zhì)，并在胃腸道模擬消化研究中表現(xiàn)出良好的保護(hù)、緩釋等優(yōu)點。LOPs是一種介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的水溶性低分子物質(zhì)，本課題組前期利用超聲波、高壓均質(zhì)成功制備出了包封LOPs的W1/O/W2型雙重乳液，且該體系在加熱、離子脅迫和酸堿等處理條件下具有較好的穩(wěn)定性。然而，目前對于LOPs的W1/O/W2型雙重乳液的消化及吸收特性的研究相對匱乏，有待進(jìn)一步深入探討。本研究基于對牡蠣低分子肽LOPs界面性質(zhì)的分析，擬構(gòu)建LOPs的W1/O/W2型雙重乳液，并利用體外模擬消化模型研究LOPs的雙重乳液經(jīng)模擬消化前后的粒徑、微觀結(jié)構(gòu)和包封率變化，進(jìn)一步采用單層Caco-2細(xì)胞模型初步研究LOPs及其雙重乳液的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收特性。本研究旨在為負(fù)載生物活性物質(zhì)的W1/O/W2型雙重乳液在延緩消化道降解，提高生物利用率方面的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

牡蠣，廣東湛江霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場;動物蛋白酶(68 000 U/g)，南寧龐博生物工程有限公司;超濾膜(Millipore Pellicon XL 5kDa)，上海必泰生物科技有限公司;吐溫80，美國Sigma-Aldrich公司;大豆油，深圳南海油脂工業(yè)(赤灣)有限公司;聚甘油蓖麻醇酸酯(polyglycerol polyricinoleate，PGPR)，噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]、二甲基亞砜(methyl sulfoxide，DMSO)、膽酸鹽(膽酸含量≥60%)、胃蛋白酶(來源于豬胃黏膜，15 000 U/g)、胰酶(BR，4 000 U/g)，上海源葉生物科技有限公司;Florisil試劑、食品級α-淀粉酶(40 000 U/g)，北京索萊寶科技有限公司;Caco-2細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫(NCACC);RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Biological Industries-上海諾寧生物科技有限公司;FBS胎牛血清、10 000 U/mL青霉素、10 mg/mL鏈霉素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的Trypsin-EDTA胰蛋白酶溶液，美國Gibco公司;D-Hanks平衡液，大連美侖生物技術(shù)有限公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)試劑盒、蛋白定量試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)，南京建成生物工程研究所;熒光素鈉，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。實驗所用試劑均為分析純，實驗所用水皆為超純水。

1.2儀器與設(shè)備

N-4000型旋蒸濃縮系統(tǒng)，東京理化器械公司;Sorvall Lynx6000型高速冷凍離心機(jī)，德國Thermo公司;B-290型噴霧干燥儀，瑞士BUCHI有限公司;ULTRA-TURRAX-T18型高速剪切機(jī)，德國IKA公司;GJB30L/h-100MPa型高壓均質(zhì)機(jī)，常州市超力均質(zhì)泵廠;OSA100型全自動界面黏彈性測量儀，北京東方德菲儀器有限公司;METTLER、S220型pH計，瑞士梅特勒-托利多國際有限公司;ZETASIZER NANO ZSE型納米粒度分析儀，英國馬爾文帕納科公司;OLYMPUS-CX43型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯光學(xué)公司;Synergy HT型高級多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰公司;BJ-J160型細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;Millicell ERS-2型電阻儀，上海默克生命科學(xué)公司;IC1000型細(xì)胞計數(shù)儀，上海艾力特生命科學(xué)有限公司;DM0412型低速離心機(jī)，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司。